डीएनए अनुक्रमण: मैक्सम-गिल्बर्ट, विधि और उदाहरण - जीवविज्ञान - 2025

डीएनए अनुक्रमण (डिऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड) आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में एक प्रक्रिया है जो की अनुमति देता है के लिए ब्याज की आनुवंशिक सामग्री में न्यूक्लियोटाइड के आदेश पता है। इसके अलावा, आरएनए (राइबोन्यूक्लिक एसिड) की अनुक्रमण का भी खुलासा किया जा सकता है।

यह तकनीक जैविक विज्ञान के विकास के लिए अपरिहार्य है। यह ज्ञान के अन्य क्षेत्रों पर भी लागू होता है - जैसे कि चिकित्सा निदान और फोरेंसिक जांच, उदाहरण के लिए।

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पहले, डीएनए स्ट्रैंड की अनुक्रमण को एक धीमी और महंगी गतिविधि माना जाता था, जिसने ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स में केवल कुछ आधार जोड़े की पहचान की अनुमति दी थी।

आज, विज्ञान में सभी प्रगति के साथ, डीएनए अनुक्रमण इस क्षेत्र में लगभग 50 वर्षों के अनुसंधान के योगदान के लिए दुनिया भर में कई प्रयोगशालाओं में एक नियमित संचालन है। श्रृंखला की लंबाई के संदर्भ में, लाखों बेस जोड़े को बहुत कम समय में अनुक्रमित किया जा सकता है।

ऐसा करने के लिए, दर्जनों तकनीकें विकसित की गई हैं जो कीमत और सटीकता में भिन्न हैं। इस लेख में, हम शास्त्रीय और आधुनिक दोनों तकनीकों का वर्णन करेंगे, प्रत्येक इसके फायदे और नुकसान के साथ।

अब तक, अनुक्रमण तकनीक छोटे प्रोकैरियोट्स और यीस्ट से लेकर मानव जीनोम तक पूरे जीनोम के अनुक्रम को प्राप्त करने की अनुमति देती है।

डीएनए संरचना

डीएनए अनुक्रमण के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों और तकनीकों को समझने के लिए, अणु की संरचना और संरचना के कुछ प्रमुख पहलुओं को जानना आवश्यक है।

डीएनए जीवाणुओं से लेकर बड़े जलीय जंतुओं तक सभी जीवित चीजों में पाया जाने वाला एक बायोमोलेक्यूल है। ऑर्गेनेल - माइटोकॉन्ड्रिया और क्लोरोप्लास्ट की तरह - उनके अंदर एक गोलाकार डीएनए अणु होता है। यहां तक ​​कि कुछ वायरस में पाया जाने वाला आनुवंशिक पदार्थ डीएनए है।

संरचनात्मक रूप से, डीएनए न्यूक्लियोटाइड का एक संग्रह है। प्रत्येक एक कार्बोहाइड्रेट, एक नाइट्रोजनस बेस (ए, टी, सी या जी) और एक फॉस्फेट समूह से बना है। डीएनए अनुक्रमण का लक्ष्य उस क्रम को प्रकट करना है जिसमें अनुक्रम में चार नाइट्रोजनस आधार पाए जाते हैं।

इतिहास

1950 के दशक के मध्य में, शोधकर्ताओं वॉटसन और क्रिक ने क्रिस्टोलोग्राफिक तकनीकों का उपयोग करके डीएनए की संरचना का वर्णन किया। हालांकि, इनमें से कोई भी शोधकर्ता अनुक्रम को उजागर करने का एक तरीका नहीं खोज पाया था।

यद्यपि कुछ पूर्ववर्ती थे, सबसे महत्वपूर्ण घटना थी 1977 में सेंगर पद्धति का निर्माण। विधि के जनक फ्रेडरिक सेंगर एक ब्रिटिश जैव रसायनविद थे, जो जैविक विज्ञान में अपने विशाल योगदान के लिए दो नोबेल पुरस्कारों के विजेता थे।

इस तकनीक को साहित्य में "चेन टर्मिनेशन" या डाइडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड्स के रूप में भी जाना जाता है। इस तकनीक के सिद्धांत और जो इसके सुधार और नवाचार के आधार पर विकसित किए गए थे, उन्हें नीचे वर्णित किया जाएगा।

सेंगर विधि

सेंगर विधि के विकास ने आणविक जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण घटना का प्रतिनिधित्व किया। इसमें डीएनए प्रतिकृति प्रक्रिया के बुनियादी घटक शामिल होते हैं जो आम तौर पर सेल में होते हैं, लेकिन एक विशेष घटक को जोड़ते हैं: dideoxynucleotides।

प्रतिक्रिया के मुख्य घटक

- डीएनए पोलीमरेज़: डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण तत्व है। यह अणु डीएनए स्ट्रैंड की प्रतिकृति में भाग लेता है और इसकी भूमिका नए स्ट्रैंड का संश्लेषण है, जो पूरक लोगों के साथ ट्राइफॉस्फेट डीऑक्सीरिबोन्यूक्लियोटाइड्स की जोड़ी है।

याद रखें कि डीएनए में, दो हाइड्रोजन बांडों के माध्यम से एडेनिन (ए) के साथ थाइमाइन (टी) जोड़ी, जबकि साइटोसिन (सी) तीन बांडों के माध्यम से गुआनिन (जी) के साथ ऐसा करती है।

- न्यूक्लियोटाइड्स: सेंगर अनुक्रमण में दो प्रकार के न्यूक्लियोटाइड्स शामिल होते हैं, चार 2'-deoxynucleotides (संक्षिप्त रूप में डीएटीपी, डीजीटीपी, डीटीसीटी और डीटीटीपी) और चार डायडेक्स न्यूक्लियोटाइड्स (डीडीएटीपी, डीडीजीटीपी, डीडीसीटीपी और डीडीटीटीपी)।

हालांकि डिडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड्स मोनोमर्स के समान हैं जो सामान्य रूप से डीएनए में शामिल होते हैं, उनकी संरचना में -OH समूह की कमी होती है। इससे श्रृंखला में एक नया न्यूक्लियोटाइड जोड़ना असंभव हो जाता है।

इस कारण से, जब एक विशेष न्यूक्लियोटाइड जोड़ा जाता है - पूरी तरह से यादृच्छिक तरीके से - निर्माण में श्रृंखला के लिए, संश्लेषण बंद हो जाता है। इस प्रकार, प्रतिक्रिया के अंत में, विभिन्न आकारों की श्रृंखलाएं होती हैं, प्रत्येक जहां एक अलग बिंदु पर प्रतिक्रिया रोक दी गई थी।

प्रयोगात्मक रूप से, चार परीक्षण तैयार किए जाते हैं। प्रत्येक में ब्याज के जैविक नमूने से निकाले गए डीएनए, सामान्य न्यूक्लियोटाइड, और चार विशेष न्यूक्लियोटाइड प्रकारों में से एक होता है। या तो विशेष न्यूक्लियोटाइड्स को कुछ प्रकार के फ्लोरोसेंट मार्कर (नीचे स्वचालित अनुक्रमण देखें) के साथ चिह्नित किया गया है।

परिणाम पढ़ना

पहला चरण प्रत्येक संश्लेषित श्रृंखला को उनके आकार के अनुसार अलग करना है। कुछ दूसरों की तुलना में अधिक लंबे होंगे, जहां पर विशेष ठिकानों को शामिल किया गया था।

विभिन्न जैव रासायनिक तकनीकें हैं जो एक भेदभावपूर्ण संपत्ति के रूप में आकार का उपयोग करके मिश्रण के घटकों को अलग करने की अनुमति देती हैं। सेंगर की विधि में, विभिन्न श्रृंखलाओं को वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जाता है। तकनीक के अधिक परिष्कृत रूपों में, केशिका वैद्युतकणसंचलन का उपयोग किया जाता है।

इस प्रकार, लंबे स्ट्रैंड्स छोटे वेरिएंट की तुलना में कम यात्रा करते हैं। यह प्रणाली तब एक पाठक के माध्यम से जाती है जो प्रत्येक डिडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड में शामिल मार्कर को पहचानती है। इस तरह, अनुक्रम के क्रम को जाना जा सकता है।

यह "पहली पीढ़ी" तकनीक डीएनए के टुकड़े को पढ़ने में सक्षम है, जो 1 किलोबाज़ से बड़ा नहीं है। वर्तमान में, सेंगर विधि का उपयोग विभिन्न प्रयोगशालाओं में किया जाता है, आमतौर पर इसके आधुनिक वेरिएंट में। इसके अलावा, इसका उपयोग सबसे जटिल तकनीकों के साथ प्राप्त परिणामों को पुष्टि करने के लिए किया जाता है - लेकिन कम सटीक।

स्वचालित अनुक्रमण

जब बड़े पैमाने पर अनुक्रमण की आवश्यकता होती है, तो स्वचालन के माध्यम से प्रक्रिया को तेज किया जाता है। यह सेंगर श्रृंखला समाप्ति विधि का एक रूपांतर है, जहां प्राइमर को फ्लोरोसेंट उत्पादों के साथ लेबल किया जाता है ताकि उन्हें अलग किया जा सके।

इसके बाद, प्रतिक्रिया उत्पाद एक वैद्युतकणसंचलन में चलाया जाता है - सभी एक ही लेन पर। जैसा कि प्रत्येक टुकड़ा जेल के अंतिम हिस्से से बाहर निकलता है, यह जल्दी से इसकी फ्लोरोसेंट लेबलिंग द्वारा पहचाना जाता है, जिसमें 1% त्रुटि होती है।

सबसे परिष्कृत प्रणालियों में एक रोबोट द्वारा युग्मित कंप्यूटर द्वारा प्रबंधित 96 केशिका ट्यूब तक की एक प्रणाली है। यानी 96 डीएनए नमूनों का एक साथ परीक्षण किया जा सकता है। इस प्रकार, इलेक्ट्रोफोरोसिस और परिणामों के विश्लेषण से जुड़ी प्रक्रिया पूरी तरह से स्वचालित है।

एक दिन में, ये सिस्टम 550,000 ठिकानों तक पहुंच सकता है। प्रक्रिया के दौरान, मानव श्रम अनावश्यक है, इस विधि को शुरू करने में केवल 15 मिनट लगते हैं।

मैक्सम-गिल्बर्ट अनुक्रमण

उसी समय जब सेंगर ने अपने काम को प्रकाशित किया, एलन मैक्सन और वाल्टर गिल्बर्ट नाम के दो शोधकर्ताओं ने डीएनए अनुक्रम प्राप्त करने के लिए एक और विधि विकसित करने में सफलता हासिल की। इस पद्धति ने उस समय लोकप्रियता हासिल की, लेकिन बाद में सेंगर की पद्धति में सुधार के कारण विस्थापित हो गए।

सेंगर विधि के विपरीत, मैक्सन और गिल्बर्ट अनुक्रमण (या रासायनिक अनुक्रमण, जैसा कि यह भी ज्ञात है) में संकर प्रतिक्रियाएं शामिल नहीं हैं। कार्यप्रणाली में एक छोर पर प्रतिक्रियाशील एजेंटों के साथ लेबलिंग होती है, इसके बाद एक शुद्धिकरण प्रक्रिया होती है।

इस तकनीक के नकारात्मक पहलुओं में से एक इसकी विशाल जटिलता और रसायनों के उपयोग में निहित है जो उपयोगकर्ता के लिए खतरनाक हैं। रासायनिक विराम लवण के साथ डीएमएस, फॉर्मिक एसिड, हाइड्रैजाइन और हाइड्रेंजिन के अनुप्रयोग से प्रेरित होते हैं।

प्रक्रिया

प्रोटोकॉल फॉस्फोरस मार्कर 32 के साथ स्ट्रैंड के 5 'छोर पर अंकन के साथ शुरू होता है, फिर नाइट्रोजन आधार का एक रासायनिक संशोधन होता है और इसे अलग किया जाता है। अंत में, एबैसिक क्षेत्र की दरार होती है।

पहले आप उस स्ट्रिंग को छोटा करें जिसे आप छोटे खंडों में अनुक्रमित करना चाहते हैं। यह कदम प्रतिबंध एंजाइमों के साथ किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप फैलने वाला अंत होता है।

अगला, प्रतिक्रिया एक क्षारीय फॉस्फेट के साथ की जाती है, जिसका उद्देश्य फॉस्फेट समूह को खत्म करना है। इस प्रकार, लेबलिंग करने के लिए एक पोलीन्यूक्लियोटाइड किनसे का उपयोग किया जा सकता है।

श्रृंखला को बदनाम किया जाता है (दो किस्में खुली)। फिर रसायन लगाए जाते हैं। इन दरार प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित तरीके से किया जाता है और यह ज्ञात होता है कि प्रत्येक लागू रासायनिक विराम किस प्रकार के बांड हैं।

परिणाम पढ़ना

जैसा कि सेंगर विधि में, परिणामों को पढ़ने में एक वैद्युतकणसंचलन प्रणाली में प्राप्त श्रृंखलाओं के आकार से अलगाव शामिल है। पॉलीएक्रिलामाइड से बना सिस्टम जेल को पढ़ने के लिए एक बहुत ही पर्याप्त समाधान प्राप्त करने की अनुमति देता है।

बड़े पैमाने पर अनुक्रमण

बड़े पैमाने पर अनुक्रमण में एनजीएस के रूप में संक्षिप्त "उपन्यास अगली पीढ़ी के अनुक्रमण" से उपन्यास विधियों की एक श्रृंखला शामिल है।

एनजीएस के रूप में वर्गीकृत तरीकों को पिछले डीएनए प्रवर्धन चरण की आवश्यकता होती है (वे एक अणु के साथ काम नहीं करते हैं)। इसके अलावा, प्लेटफार्मों का इस्तेमाल व्यापक रूप से भिन्न होता है। सबसे लोकप्रिय तरीकों के सिद्धांतों को नीचे वर्णित किया जाएगा:

pyrosequencing

इसमें पाइरोफॉस्फेट की रिहाई की निगरानी करना शामिल है, जो हर बार डीएनए स्ट्रैंड में एक नया न्यूक्लियोटाइड जोड़ा जाता है। एंजाइमों की एक प्रणाली को युग्मित किया जाता है, ताकि हर बार एक नया न्यूक्लियोटाइड शामिल होने पर प्रकाश का उत्सर्जन (जो कैमरे द्वारा पता लगाया जा सके) होता है।

प्रकाश उत्सर्जन होने या न होने की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक नाइट्रोजन आधार के अलग-अलग ऊष्मायन के साथ प्रक्रिया शुरू होती है। पैरोड्रेंसिंग लंबे किस्में पढ़ सकती है, लेकिन त्रुटि दर अधिक है।

संश्लेषण अनुक्रमण

इसमें लेबल न्यूक्लियोटाइड्स का समावेश शामिल है। इन फ्लोरोसेंट घटकों को जोड़ा जाता है, धोया जाता है, और निगमित न्यूक्लियोटाइड नोट किया जाता है। फिर, न्यूक्लियोटाइड लेबल हटा दिया जाता है, और स्ट्रैंड का संश्लेषण जारी रह सकता है। अगले चरण में, एक लेबल न्यूक्लियोटाइड भी शामिल किया जाएगा, और उपर्युक्त चरणों को दोहराया जाएगा।

इस तकनीक की एक खामी तब होती है जब फ्लोरोसेंट मार्कर पूरी तरह से नहीं हटाए जाते हैं। ये उत्सर्जन पृष्ठभूमि त्रुटियों को बनाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण त्रुटियां होती हैं।

बंधाव अनुक्रमण

यह तकनीक दूसरों से अलग है, क्योंकि यह डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग नहीं करता है। इसके बजाय, इस पद्धति का प्रमुख एंजाइम लिगेज है। यहां, फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किए गए डीएनए टुकड़े का उपयोग किया जाता है, यह एंजाइम द्वारा जुड़ा हुआ है और इसका पता लगाया गया है।

इस तकनीक के साथ सबसे बड़ी समस्या यह है कि यह प्रक्रिया में सक्षम छोटी खंड लंबाई है।

आयन टोरेंट सीक्वेंसिंग

यह तकनीक एच ⁺ आयन की माप पर आधारित है जिसे हर बार एक नया न्यूक्लियोटाइड शामिल किया जाता है। सिद्धांत पाइरोडिंग के समान है, लेकिन बहुत सस्ता है।

उदाहरण

मानव जीनोम का अनुक्रमण

मानव जीनोम को जीतना जीव विज्ञान में सबसे आशाजनक चुनौतियों में से एक रहा है, साथ ही विज्ञान के इतिहास में सबसे प्रशंसित प्रतिद्वंद्वियों में से एक है। वास्तव में, इस परियोजना में शामिल वैज्ञानिकों के लिए, जीनोम अनुक्रमण एक प्रतियोगिता बन गया।

1990 में उन्होंने प्रसिद्ध वैज्ञानिक, नोबेल पुरस्कार विजेता, जेम्स वाटसन के नेतृत्व में "मानव जीनोम परियोजना" को शुरू किया। एक साल बाद, 1991 में, वेंटर वॉटसन को "पिटाई" करने की चुनौती लेता है और उसके सामने जीन को सीक्वेंस करता है। हालांकि, 1992 में वॉटसन सेवानिवृत्त हो गए और कमान एक अन्य शोधकर्ता ने ले ली।

1995 में वेंटर ने यादृच्छिक अनुक्रमण विधि द्वारा एक जीवाणु जीनोम के पूर्ण अनुक्रमण में अपनी सफलता की घोषणा की। इसी तरह, विरोधी टीम ने एक साल बाद खमीर जीनोम की अनुक्रमणिका की घोषणा की।

2000 में, डिग्री को समाप्त कर दिया गया था। दोनों कंपनियों ने विज्ञान के दो सबसे प्रतिष्ठित पत्रिकाओं में अपने प्रारंभिक पूरे जीनोम परिणाम प्रकाशित किए: प्रकृति और विज्ञान।

हालांकि, वैज्ञानिकों ने प्रस्तावों में सुधार करने के लिए काम करना जारी रखा, और 2006 में कुछ मानव गुणसूत्रों के अनुक्रम को पूरा किया गया।

महत्व और अनुप्रयोग

डीएनए के रूप में इस तरह के एक महत्वपूर्ण अणु के न्यूक्लियोटाइड्स के आदेश को जानना जीवविज्ञानी और संबंधित पेशेवरों के लिए मूल्यवान है। पॉली न्यूक्लियोटाइड की इस श्रृंखला में जीवन के सभी रूपों के विकास और रखरखाव के लिए आवश्यक सभी जानकारी शामिल है।

इन कारणों से, जैविक अनुसंधान के लिए इस अनुक्रम का ज्ञान आवश्यक है। मौलिक रूप से, अनुक्रमण जैविक प्रणालियों के सबसे महत्वपूर्ण गुणों में से एक को मापना और उनके बीच अंतर स्थापित करना संभव बनाता है।

सीक्वेंसिंग व्यापक रूप से टैक्सोनोमिस्ट्स और सिस्टमैटिस्ट द्वारा उपयोग किया जाता है, क्योंकि कुछ डीएनए अनुक्रमों से यह निष्कर्ष निकालना संभव हो जाता है कि दो जीव एक ही प्रजाति के हैं या नहीं, इसके अलावा, उनके बीच के फ़िगोलेनेटिक संबंधों के बारे में परिकल्पना का प्रस्ताव करने में सक्षम है।

इसके अतिरिक्त, डीएनए अनुक्रमण में चिकित्सा और निदान में अनुप्रयोग हैं। उदाहरण के लिए, सस्ती और सुलभ प्रणालियां हैं, जो अनुक्रमण के माध्यम से, तथाकथित एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (एसएनपी) का उपयोग करके कुछ बीमारियों (जैसे कैंसर) को विकसित करने की प्रवृत्ति का आकलन करना संभव बनाती हैं।

आपराधिक और फोरेंसिक प्रकार की जांच को भी अनुक्रमण तकनीक से समृद्ध किया गया है, जिसका उपयोग किसी अपराध में एक निश्चित व्यक्ति की भागीदारी के विश्वसनीय सबूत के रूप में किया जा सकता है।

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