बैक्टीरियल स्मीयर: विशेषताओं और तैयारी - जीवविज्ञान - 2025

बैक्टीरियल धब्बा एक पतली फिल्म है धब्बा है कि एक प्रकाश खुर्दबीन के नीचे एक पारदर्शी कांच की प्लेट या स्लाइड पर किया जाता है, अवलोकन के लिए जीवाणु सूक्ष्मजीवों की एक निलंबन की।

फिल्म के रूप में विस्तार सूक्ष्मजीवों को जितना संभव हो उतना अलग करने के लिए किया जाता है, क्योंकि अगर उन्हें समूहबद्ध किया जाता है तो अवलोकन स्पष्ट नहीं है।

चित्रा 1. एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत देखा जाने वाला बैक्टीरियल स्मीयर। स्रोत: pixbay.com

जीवाणु संस्कृतियों के अध्ययन में, स्मीयर तैयारी, निर्धारण और धुंधला तकनीक का उपयोग उन्हें बेहतर विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। सूक्ष्मजीवों के छोटे आकार के कारण, उनके अवलोकन के लिए एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग आवश्यक है।

स्मीयरों के अवलोकन के लिए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप आवश्यक उपकरण हैं। ये ऑप्टिकल लेंस और प्रकाश को नियोजित करते हैं जो उच्च आवर्धन के साथ नमूनों को देखने की अनुमति देते हैं।

सामान्य तौर पर, जीवित कोशिकाओं में ज्यादातर रंगीन संरचनाएं नहीं होती हैं, जिन्हें प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ देखा जाता है वे रंगहीन, पारदर्शी नमूने होते हैं, और वे बहुत कम आंतरिक विपरीत और अपने वातावरण के साथ दिखाते हैं।

सहायक धुंधला तकनीकों के उपयोग के बिना सरल प्रकाश-क्षेत्र प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ अवलोकन, बहुत सीमित है और केवल कुछ मामलों में उपयोग किया जाता है, जैसे कि सूक्ष्मजीवों के आंदोलन का अवलोकन।

सूक्ष्मजीवों के इष्टतम अवलोकन के लिए, इसके विपरीत और संकल्प के बीच एक संतुलन होना चाहिए। सेल विवरण को एक माइक्रोस्कोप के तहत नहीं देखा जा सकता है, यहां तक ​​कि उच्च रिज़ॉल्यूशन के साथ भी; रंजक तकनीकों के माध्यम से रंजक का उपयोग आवश्यक है, जो अवलोकन के लिए विपरीत प्रदान करते हैं।

एक अच्छी गुणवत्ता वाले जीवाणु स्मीयर के लक्षण

उत्कृष्ट विपरीत

उत्कृष्ट विपरीतता प्राप्त करने के लिए चरण विपरीत माइक्रोस्कोप, अंतर हस्तक्षेप माइक्रोस्कोप और डार्क फील्ड माइक्रोस्कोप नामक परिष्कृत सूक्ष्मदर्शी होते हैं। इस प्रकार के माइक्रोस्कोप का उपयोग बैक्टीरिया संरचनाओं जैसे कि म्यान और फिलामेंट्स, दूसरों के बीच निरीक्षण करने के लिए किया जाता है।

धुंधला एक विपरीत तकनीक को बढ़ाने के लिए एक सरल तकनीक है जो ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के साथ हासिल की जाती है। इस तकनीक में, विभिन्न दागों का उपयोग किया जा सकता है, जो सूक्ष्म अवलोकन में काफी सुधार करते हैं।

दाग धब्बों या सूक्ष्मजीवों के विस्तार पर सीधे स्लाइड पर किए जाते हैं, पहले सूख गए और ठीक हो गए।

अच्छा तय है

निर्धारण एक ऐसी तकनीक है जिसका उपयोग कोशिका संरचनाओं को संरक्षित करने के लिए किया जाता है; सूक्ष्मजीवों को निष्क्रिय करने और स्लाइड के कांच को आसंजन का कारण बनता है। अलग-अलग फिक्सिंग उपचार हैं: गर्मी निर्धारण और रासायनिक निर्धारण।

हीट फिक्सेशन

बैक्टीरियल स्मीयरों के अवलोकन के लिए यह सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। तकनीक में एक लाइटर की लौ के माध्यम से स्मीयर के जीवाणु निलंबन को पारित करना शामिल है। यह तकनीक बैक्टीरिया की बाहरी आकृति विज्ञान को संरक्षित करने में सक्षम है, लेकिन उनकी आंतरिक संरचनाओं को नष्ट कर देती है।

रासायनिक निर्धारण

रासायनिक निर्धारण अन्य जैसे कि फार्मलाडेहाइड या फॉर्मेलिन, इथेनॉल और एसिटिक एसिड जैसे संरक्षण रसायनों का उपयोग करता है। रासायनिक फिक्सिंग एजेंटों का उपयोग करने का लाभ यह है कि सूक्ष्मजीवों के आंतरिक सेलुलर संरचनाओं का संरक्षण प्राप्त होता है।

चित्रा 2. रक्त धब्बा। स्रोत: बोब्जालिंडो, विकिमीडिया कॉमन्स से

अच्छा धुंधला

पहले से सूखे और निश्चित स्मीयर को धुंधला करने के लिए सबसे आम प्रक्रियाएं सकारात्मक या सरल धुंधला, अंतर धुंधला हो जाना और नकारात्मक धुंधला हो जाना है। विशेष सेल संरचनाओं (कैप्सूल, बीजाणु, फ्लैगेला) के धुंधला होने के लिए विशेष तकनीकें भी हैं।

सकारात्मक धुंधला या साधारण धुंधला

सकारात्मक या सरल धुंधला सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया धब्बा धुंधला तकनीक है। यह उन रंगों का उपयोग करता है जो कुछ माइक्रोबियल संरचनाओं को बांधने की क्षमता रखते हैं, जिससे उन्हें माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है।

इन रंगों में उनकी रासायनिक संरचना में क्रोमोफोर समूह (रंगीन भाग) होते हैं, बारी-बारी से दोहरे बंध और एकल बंध (संयुग्मन) होते हैं। ये बंधन कुछ सेलुलर संरचनाओं के साथ आयनिक या सहसंयोजक बांड स्थापित कर सकते हैं।

धनात्मक या सरल धुंधला में प्रयुक्त डाई ज्यादातर एनिलिन (रंगीन कार्बनिक लवण) के रासायनिक व्युत्पन्न हैं।

दूसरी ओर, रंजक के बीच हम एक मूल पीएच के साथ कुछ और अन्य एक अम्लीय पीएच के साथ पा सकते हैं।

मूल रंग

बुनियादी रंजक में, क्रोमोफोर समूह में एक सकारात्मक विद्युत आवेश होता है। प्रोकैरियोटिक सूक्ष्मजीवों के विशाल बहुमत में एक तटस्थ आंतरिक पीएच होता है, और उनकी कोशिका की सतह को नकारात्मक रूप से चार्ज किया जाता है। इस इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के माध्यम से, क्रोमोफोर कोशिका को बांधता है और इसे दाग देता है।

बुनियादी रंगों के उदाहरण मेथिलीन ब्लू, क्रिस्टल वायलेट, मैलाकाइट ग्रीन, बेसिक फ्यूसीन, सफारी, अन्य हैं।

एसिड डाई

एसिड रंजक में, क्रोमोफोर समूह में एक नकारात्मक विद्युत आवेश होता है। ये सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए अमीनो समूहों के साथ प्रोटीन को दागने के लिए उपयोग किया जाता है। एसिड रंजक के उदाहरण एसिड फ्यूसीन, गुलाब बंगाल, कांगो लाल और ईओसिन हैं।

अंतर धुंधला हो जाना

अंतर धुंधला तकनीक में माइक्रोस्कोप के तहत विभिन्न सूक्ष्मजीवों को अलग करने के लिए, अलग-अलग रंग या तीव्रता के दो रंगों को लागू करना शामिल है। जीवाणु विज्ञान में ग्राम दाग और एसिड-अल्कोहल प्रतिरोध दाग सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला अंतर है।

ग्राम दाग का उपयोग आकार, आकार, कोशिका समूहन के साथ-साथ कोशिका भित्ति के प्रकार को जानने के लिए एक प्रारंभिक परीक्षण के रूप में किया जाता है। ग्राम दाग परीक्षण का उपयोग करके, सेल की दीवार के बैक्टीरिया को ग्राम सकारात्मक बैक्टीरिया और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया में वर्गीकृत किया जाता है।

नकारात्मक धुंधला

इस तकनीक में, रासायनिक रंगों का उपयोग किया जाता है जो कोशिका के आंतरिक भाग में प्रवेश नहीं करते हैं, लेकिन उस माध्यम को बनाते हैं जिसमें सूक्ष्मजीव एक काले रंग की पृष्ठभूमि के रूप में दिखाई देते हैं।

नकारात्मक धुंधला तकनीक में, स्मीयर को भारत स्याही या निग्रोसिन निलंबन की एक बूंद के साथ बनाया जाता है, जो कमरे के तापमान पर सूखने की अनुमति देने के बाद प्रकाश के पारित होने के लिए एक अपारदर्शी फिल्म बनाता है। इस तरह, सूक्ष्मजीव एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर चमकदार आकृतियों के रूप में दिखाई देते हैं।

तैयारी

A. धब्बा

1.- स्लाइड्स को बहुत अच्छे से धोएं, अब्सॉर्बेंट पेपर से सुखाएं और उन्हें लेबल करें। लेबल को तैयारी की सामग्री, दिनांक और उस व्यक्ति के नाम का संकेत देना चाहिए जिसने इसे संसाधित किया है।

2.- प्रकाश को हल्का करें और चमकीले लाल होने तक लौ में इनोक्यूलेशन लूप को स्टरलाइज़ करें।

3.- हैंडल को ठंडा होने दें।

4.- बैक्टीरियल कल्चर ट्यूब लें, कैप निकालें और बर्नर की लौ (लौ) के पास ट्यूब के मुंह को जल्दी से पास करें।

5.- जीवाणु संस्कृति वाले ट्यूब में इनोक्यूलेशन लूप डालें और नमूना लें।

6.- यदि संस्कृति तरल माध्यम में है, तो स्लाइड के केंद्र में संभाल के साथ लिए गए नमूने को रखें और इसे लगभग 2 सेमी व्यास के सर्कल में सावधानी से फैलाएं।

7.- इनोक्यूलेशन लूप को फिर से स्टरलाइज़ करें।

8.- धब्बा को हवा में सूखने दें।

9.- चरण 3 से 8 तीन बार दोहराएं।

10.- यदि संस्कृति ठोस माध्यम में है, तो आसुत जल की एक बूंद को पहले स्लाइड पर रखा जाना चाहिए। यह इनोक्यूलेशन लूप के साथ ली गई संस्कृति का एक छोटा सा नमूना मिश्रण करने के लिए किया जाता है, जैसा कि चरण 2 से 5 (सड़न रोकनेवाला स्थिति) में निर्देशित है।

11.- स्लाइड पर पानी की बूंद के साथ पतला नमूना फैलाएं और तीन बार दोहराएं।

बी। निर्धारण

1.- सूखे स्मीयरों में मेथनॉल या पूर्ण इथेनॉल की दो बूंदें - तरल माध्यम में संस्कृतियों से -।

2.- लाइटर से हवा को सूखने दें।

3.- अगर स्मीयर ठोस माध्यम में एक कल्चर से आता है, तो ड्राई स्मीयर को गर्मी के साथ तय किया जाता है, इसे हल्की लौ के सबसे गर्म हिस्से से 2 से 3 बार जल्दी से गुजारें।

4.- बाएं हाथ के पृष्ठीय भाग के साथ स्मीयर के निचले हिस्से को स्पर्श करें (दाएं हाथ के लिए, अन्यथा, दाहिने हाथ का उपयोग करें) और सत्यापित करें कि यह ठंडा है।

सी। सरल धुंधला

1.- स्मीयर के लिए चयनित दाग की 2 बूंदें जोड़ें और प्रत्येक दाग के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल में आवश्यक समय के लिए कार्य करना छोड़ दें (आमतौर पर 1 और 5 मिनट के बीच)।

2.- कुछ दागों को अपनी सक्रियता के लिए ऊष्मा के उपयोग की आवश्यकता होती है, ऐसे में हल्की आंच में स्लाइड को गर्म करते समय बहुत सावधानी बरतने की जरूरत होती है। (चिमटी से इसे धोएं और उबलने से बचें)। स्मीयर को गर्म करने से कोशिकाओं को देखा जा सकता है।

3.- एक पिकेट से डिस्टिल्ड वाटर से धो कर अतिरिक्त कलर्स को निकालें। धीरे से काम के टेबल पर झुका हुआ, इसके किनारे पर स्लाइड को टैप करके वॉश वॉटर निकालें।

4.- हवा को सूखने दें।

5.- अवलोकन के प्रकार के आधार पर, इस स्तर पर एक आवरण का उपयोग किया जाता है या नहीं। कवरलिप स्मीयर की सुरक्षा और संरक्षण करता है। यदि इस स्तर पर एक तेल विसर्जन अवलोकन किया जाता है, तो कोई भी कवरलिप्स का उपयोग नहीं किया जाता है, लेकिन स्मीयर को संरक्षित नहीं किया जा सकता है।

डी। स्मीयर का निश्चित संरक्षण

1.- नीचे दिए गए प्रत्येक समाधान में, न्यूनतम 5 मिनट के लिए स्मीयर को क्रमिक रूप से विसर्जित करें। इन "स्नान" का उद्देश्य धब्बा को पूरी तरह से निर्जलित करना है। प्रत्येक अभिकर्मक को अगले स्नान में स्मीयर को पेश करने से पहले अच्छी तरह से सूखा होना चाहिए।

निर्जलित स्नान का क्रम निम्नानुसार है:

1. इथेनॉल 70%
2. इथेनॉल 95%
3. शुद्ध एसीटोन
4. एसीटोन -xylol 1: 1 मिश्रण
5. XYLOL

फिर हवा में सूखने दें।

2.- कनाडा बेलसम या अन्य बढ़ते माध्यम का उपयोग करते हुए, अधिमानतः 22 × 22 मिमी, कवरलिप माउंट करें।

संदर्भ

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