ग्राम दाग: औचित्य, सामग्री, तकनीक और उपयोग - जीवविज्ञान - 2025

ग्राम स्टेन सरल और सबसे उपयोगी है धुंधला नैदानिक सूक्ष्म जीव विज्ञान में तकनीक। यह तकनीक 1884 में डेनिश डॉक्टर हंस क्रिश्चियन ग्राम द्वारा बनाई गई थी, जो सेल दीवार की संरचना के अनुसार बैक्टीरिया को ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक के रूप में वर्गीकृत करने में कामयाब रहे।

1921 में अभिकर्मकों को स्थिर करने और धुंधला की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए तकनीक ने कुछ संशोधनों के तहत कुछ संशोधनों को रेखांकित किया, यही वजह है कि ग्राम दाग को ग्राम-हकर के रूप में भी जाना जाता है।

ग्राम के दाग के साथ विभिन्न स्मीयर। उ। ग्राम पॉजिटिव कोक्सी। B. ग्राम नकारात्मक छड़। सी। ग्राम पॉजिटिव, पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर और मोनोन्यूक्लियर बेसिली। डी। खमीर।

इस तकनीक के साथ सूक्ष्मजीवों के आकार का निरीक्षण करना भी संभव है, अर्थात्, अगर वे कोसी, बेसिली, कोकोबैसिली, प्लेमॉर्फिक, फिलामेंटस, आदि हैं। अंतरिक्ष में इसके वितरण के साथ-साथ: एक क्लस्टर में, एक श्रृंखला में, अलग-थलग, जोड़े में, टेट्राड्स आदि में।

जब एक जीवाणु संक्रमण का संदेह होता है, तो प्राप्त किए गए अधिकांश नमूनों को एक स्लाइड पर सुखाया जाना चाहिए और सूक्ष्म परीक्षण के लिए ग्राम को दाग दिया जाना चाहिए।

ग्राम रिपोर्ट अंतिम संस्कृति परिणाम प्राप्त करने से पहले डॉक्टर को निर्देशित करेगी कि किस प्रकार का सूक्ष्मजीव संक्रमण का कारण हो सकता है।

कुछ मामलों में रोगी के जीवन में बहुत समझौता होता है, इसलिए डॉक्टरों को एक अनुभवजन्य उपचार के लिए तत्काल ग्राम रिपोर्ट की आवश्यकता होती है, जबकि वे सूक्ष्मजीव की पहचान के लिए प्रतीक्षा करते हैं।

उदाहरण के लिए, अगर ग्राम से पता चलता है कि मस्तिष्कमेरु तरल पदार्थ में ग्राम पॉजिटिव कोसी हैं, तो डॉक्टर इस के लिए स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार, इस प्रकार के बैक्टीरिया को खत्म करने वाले एंटीबायोटिक दवाओं के साथ प्रारंभिक चिकित्सा का मार्गदर्शन करेंगे।

एक बार अंतिम परिणाम अलग-थलग सूक्ष्मजीव और उसके संबंधित एंटीबायोग्राम के नाम के साथ आता है, तो चिकित्सक चिकित्सा को बदलने या न करने के लिए मूल्यांकन करेगा। यह निर्णय उसे प्राप्त होने वाले एंटीबायोटिक दवाओं और रोगी के विकास के लिए सूक्ष्मजीव की संवेदनशीलता के अध्ययन के अनुसार किया जाएगा।

आधार

यह एक तकनीक है जिसमें 4 मौलिक चरण हैं: धुंधला हो जाना, मोर्डेंट के साथ निर्धारण, मलिनकिरण और काउंटरस्टैन। इसलिए, यह तकनीक, बैक्टीरिया को रंग देने के अलावा, उन्हें विभेदित करने की भी अनुमति देती है।

क्रिस्टल वायलेट पहला रंगीन प्रयोग किया जाता है। इसमें पेप्टिडोग्लाइकन के लिए एक आत्मीयता है और बैंगनी मौजूद सभी जीवाणुओं को दाग देगा, बाद में लुगोल को रखा जाता है, जो एक मोर्डेंट के रूप में कार्य करता है, अर्थात यह सेल के भीतर अघुलनशील क्रिस्टल वायलेट-आयोडीन कॉम्प्लेक्स - राइबोन्यूक्लियर प्रोटीन के गठन को प्रेरित करेगा। ।

ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया, पेप्टिडोग्लाइकन की मोटी दीवार वाले, अधिक जटिल (क्रिस्टल वायलेट-आयोडीन) बनाते हैं, इसलिए वे डाई को बरकरार रखते हैं।

इसके अलावा, यह भी प्रभावित करता है कि ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया की दीवार में अधिक मात्रा में असंतृप्त एसिड होते हैं, जो ऑक्सीकरण एजेंटों (लुगोल) के लिए महान समानता दिखाते हैं।

इस बीच, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया में पेप्टिडोग्लाइकेन की एक पतली परत होती है, जो बैक्टीरिया को ग्राम सकारात्मक की तुलना में कम जटिल बनाने का कारण बनती है।

फिर मलिनकिरण कदम आता है, जहां ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया अलग तरह से व्यवहार करते हैं।

ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया में एक बाहरी झिल्ली होती है जो लिपोपॉलीसेकेराइड से समृद्ध होती है जो उनकी कोशिका भित्ति का हिस्सा होती है। एसीटोन अल्कोहल के संपर्क में आने से वसा नष्ट हो जाती है, इसलिए बाहरी झिल्ली अस्थिर हो जाती है, जिससे वायलेट क्रिस्टल निकलता है।

यह तब है जब इसे लाल रंग में बदलकर सफ़ारीनिन या बेसिक फ़्यूचिन से जोड़ा जाता है।

ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के मामले में, वे लुप्त होती का विरोध करते हैं क्योंकि ब्लीच छिद्रों को बंद करके काम करता है, जिससे क्रिस्टल वायलेट / आयोडीन कॉम्प्लेक्स को लीक होने से रोका जा सकता है।

इसलिए, क्रिस्टल वायलेट के साथ रंग स्थिर रहता है, और सफारी या फुकसिन के लिए कोई जगह नहीं है। यही कारण है कि ये बैक्टीरिया गहरे नीले या बैंगनी रंग का दाग लगाते हैं।

सामग्री

ग्राम के धुंधला सेट में निम्न शामिल हैं:

• वायलेट ग्लास
• Lugol
• एसीटोन शराब
• सफ़रिन या बुनियादी फ़ुचिन

रंजक और अभिकर्मकों की तैयारी

क्रिस्टल वायलेट समाधान

का हल:

वायलेट क्रिस्टल ------------- 2 जीआर

एथिल अल्कोहल 95% ----------- 20cc

समाधान बी:

अमोनियम ऑक्सालेट ----------- 0.8 जीआर

आसुत जल ------------- 80 cc

क्रिस्टल वायलेट की अंतिम तैयारी के लिए, समाधान ए को डिस्टिल्ड पानी के साथ 1:10 पतला होना चाहिए और समाधान बी के 4 भागों के साथ मिलाया जाना चाहिए। मिश्रण को उपयोग करने से पहले 24 घंटे तक संग्रहीत किया जाता है। फिल्टर पेपर का उपयोग करके एक एम्बर धुंधला बोतल में फ़िल्टर करें।

दैनिक उपयोग की जाने वाली राशि को एम्बर ड्रॉपर बोतल में स्थानांतरित किया जाता है।

Iodo-Lugol

प्रत्येक यौगिक की संकेतित मात्रा को मापें और मापें:

आयोडीन क्रिस्टल ------------- 1gr

पोटेशियम आयोडाइड ------------- 2gr

आसुत जल ------------- 300 cc

पोटेशियम आयोडाइड पानी में बहुत कम घुलता है और फिर आयोडीन मिलाया जाता है। समाधान एक एम्बर बोतल में मुंडा है।

दैनिक उपयोग की जाने वाली राशि को ड्रॉपर के साथ एक छोटी एम्बर बोतल में स्थानांतरित किया जाता है।

विरंजन

95% एथिल अल्कोहल ----------- 50 मिलीलीटर

एसीटोन ------------------ 50 मिली

इसे बराबर भागों में तैयार किया जाता है। अच्छी तरह से कवर करें, क्योंकि यह वाष्पित हो जाता है।

एक ड्रॉपर बोतल में रखें।

यह तैयारी 5-10 सेकंड में मध्यम समय में एक मलिनकिरण प्रदान करती है और सबसे अधिक अनुशंसित है।

शुरुआती केवल 95% एथिल अल्कोहल का उपयोग करना पसंद करते हैं, जहां लुप्त होती 10 से 30 सेकंड से धीमी है।

जबकि अधिक अनुभवी शुद्ध एसीटोन का उपयोग कर सकते हैं, जहां 1 से 5 सेकंड तक मलिनकिरण बहुत जल्दी होता है।

कंट्रास्ट

Safranin स्टॉक समाधान

सफ्रिना ------------- 2.5 जीआर

एथिल अल्कोहल 95% --------- 100 सीसी

सफ़रिन की संकेतित मात्रा का वजन करने के बाद, इसे 100% 95% एथिल अल्कोहल में भंग कर दिया जाता है।

काम करने वाले सफारी समाधान स्टॉक समाधान से तैयार किया जाता है।

ऐसा करने के लिए, स्टॉक समाधान के 10 सीसी को मापें, 100 मिलीलीटर बनाने के लिए आसुत जल का 90 सीसी जोड़ें।

एक एम्बर बोतल के साथ एक ड्रॉपर के साथ दैनिक उपयोग की जाने वाली राशि को स्थानांतरित करने की सिफारिश की जाती है।

सूक्ष्मजीव जो ग्राम-हकर के दाग के साथ ग्राम नकारात्मक को दाग देते हैं, जैसे कि कुछ एनारोबेस, लेगियोनेला एसपी, कैम्पिलोबैक्टर एसपी और ब्रुसेला एसपी, कोपॉफ द्वारा ग्राम-हकर के दाग के संशोधन का उपयोग करके बहुत बेहतर दाग लगाया जा सकता है, जिसे ग्राम-कोपेलॉफ़ दाग कहा जाता है।

यह तकनीक सफ़ारीन डाई को बुनियादी फ़ुचिन में बदलती है। इस संशोधन के साथ उपरोक्त सूक्ष्मजीवों को प्रभावी ढंग से रंगना संभव है।

अभिकर्मक भंडारण

तैयार किए गए colorants को कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।

रंगीन होने के लिए नमूने के धब्बा की तैयारी

एक नमूने में कम से कम 10 ⁵ सूक्ष्मजीव होने चाहिए, इससे पहले कि स्मीयर में सूक्ष्मजीव का अवलोकन संभव हो। स्मीयर को सीधे नमूने से या ठोस या तरल मीडिया में संस्कृतियों से बनाया जा सकता है।

स्मीयर एक समान होना चाहिए, अच्छी तरह से वितरित और बहुत मोटी नहीं, मौजूद संरचनाओं के बेहतर दृश्य के लिए।

प्रत्यक्ष नमूने के -ग्राम

अप्रकाशित मूत्र का ग्राम

मूत्र मिलाया जाता है और एक स्लाइड पर 10 μl रखा जाता है। कम से कम एक बैक्टीरिया / डिप फील्ड के अवलोकन से संकेत मिलता है कि संक्रमण है।

इसका मतलब यह है कि संस्कृति में 85% मामलों में लगभग 100,000 से अधिक सीएफयू / एमएल (10 ⁵ सीएफयू / एमएल) मूत्र होगा।

यह विधि 100,000 CFU से नीचे कॉलोनी की गणना के लिए उपयोगी नहीं है।

CSF ग्राम

सीएसएफ को अपकेंद्रित किया जाना चाहिए, सतह पर तैरनेवाला हटा दिया जाता है, और एक स्लाइड पर गोली फैल जाती है। यह तरल सामान्य परिस्थितियों में बाँझ है; बैक्टीरिया का अवलोकन संक्रमण को इंगित करता है।

सांस के नमूनों का ग्राम

थूक, ब्रोन्कियल या ब्रोन्कोएलेवल लैवेज ग्राम, हालांकि सूक्ष्मजीवों की एक किस्म हो सकती है, हमेशा निदान के लिए मार्गदर्शन करेगी, इसके अलावा उपयोगी कोशिकाओं के प्रकार भी देखे जा सकते हैं।

बलगम के मामले में, स्मीयर को नमूने के सबसे शुद्ध भागों के साथ तैयार किया जाना चाहिए।

मल का ग्राम

इस प्रकार के नमूनों पर ग्राम प्रदर्शन करने की अनुशंसा नहीं की जाती है, क्योंकि इसका कोई नैदानिक ​​मूल्य नहीं है।

-फलों की फसल

उन्हें दो तरीकों से किया जा सकता है, एक तरल संस्कृतियों से और दूसरा ठोस संस्कृतियों से।

तरल संस्कृतियों

तरल संस्कृतियों से यह अत्यंत सरल है; बादल शोरबा के कई रोटरों को बर्नर के नीचे ले जाया जाता है और एक साफ और सूखी स्लाइड पर रखा जाता है, जिससे केंद्र से परिधि की ओर परिपत्र आंदोलनों, सामग्री को समान रूप से वितरित किया जा सके।

इसे अनायास हवा में सूखने दें। एक बार सूखने पर, सामग्री को गर्मी के साथ शीट पर तय किया जाता है। ऐसा करने के लिए, चिमटी की मदद से, बन्सन बर्नर की लौ के माध्यम से शीट को 3 से 4 बार पारित किया जाता है, इस बात का ख्याल रखते हुए कि सामग्री को जला न जाए।

शीट को ठंडा करने की अनुमति दी जाती है और इसे रंग के पुल पर रखा जाता है।

ठोस फसलें

एक ठोस संस्कृति से ग्राम दाग के लिए एक धब्बा प्रदर्शन करने के लिए, निम्नानुसार आगे बढ़ें:

कॉलोनियों को चुनने से पहले, स्लाइड को तैयार किया जाना चाहिए, बाँझ शारीरिक खारा समाधान के लगभग दो बूंदों को डालना।

यदि मूल संस्कृति प्लेट में कई अलग-अलग प्रकार की कॉलोनियां होती हैं, तो प्रत्येक का एक अलग कॉलोनी को ग्राम प्रदर्शन के लिए चुना जाएगा। प्रत्येक कॉलोनी को प्लैटिनम लूप के साथ लिया जाएगा, जिसे पहले स्लाइड पर रखा गया खारा समाधान में भंग किया जा सकता है।

परिधि की ओर केंद्र से परिपत्र आंदोलनों को बनाया जाता है, स्लाइड पर कॉलोनी को सजातीय रूप से वितरित करने के लिए।

इसे अनायास हवा में सूखने दें। एक बार सूखने के बाद, शीट को गर्मी के साथ तय किया जाता है, जैसा कि पहले समझाया गया है (लाइटर के साथ स्लाइड को जलाकर), ध्यान रखें कि सामग्री को जला न जाए।

यह प्रक्रिया प्रत्येक भिन्न प्रकार की कॉलोनी के साथ की जानी चाहिए। कागज के एक टुकड़े पर, जो देखा जाता है उसका क्रम नोट किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए:

कॉलोनी 1: बीटा-हेमोलिटिक पीली कॉलोनी: ग्राम पॉजिटिव कोक्सी समूहों में देखे गए थे

कॉलोनी 2: क्रीम रंग की कॉलोनी, हेमोलिसिस के बिना: ग्राम नकारात्मक कॉकोबैसिली देखी गई।

प्रत्येक स्लाइड को यह जानने के लिए लेबल किया जाना चाहिए कि हम क्या देख रहे हैं।

तकनीक

ग्राम धुंधला तकनीक प्रदर्शन करने के लिए बेहद आसान है और अपेक्षाकृत सस्ती है और एक माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशाला में याद नहीं किया जा सकता है।

यह निम्नानुसार किया जाता है:

1. धुंधला हो जाना और धुंधला पुल पर जगह के साथ स्मीयर को ठीक करें।
2. 1 मिनट के लिए क्रिस्टल वायलेट के साथ स्लाइड को पूरी तरह से कवर करें।
3. पानी से धो लें सूखा नहीं
4. लुगोल समाधान के साथ शीट को कवर करें, 1 मिनट के लिए कार्य करने के लिए छोड़ दें। पानी से धो लें सूखा नहीं।
5. शराब एसीटोन में कोमल मिलाते हुए 5-10 सेकंड के लिए ब्लीच करें। या, शीट को एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में रखें और सतह पर डिकॉइज़र की बूंदों को तब तक रखें जब तक कि अपरिवर्तित वायलेट ग्लास को हटा न दिया जाए। से अधिक नहीं।
6. पानी से धो लें सूखा नहीं।
7. धुंधला पुल पर स्लाइड को बदलें और सफारी (ग्राम-हकर) के साथ 30 सेकंड के लिए कवर करें या बेसिक फुचिन (ग्राम-कोपलॉफ) के साथ 1 मिनट।
8. पानी से धो लें
9. इसे एक सीधी स्थिति में अनायास हवा में सूखने दें।

एक बार सूखने के बाद, प्रकाश माइक्रोस्कोप में 100X उद्देश्य के तहत विसर्जन तेल की 1 बूंद रखें।

उपयोगिता

यह तकनीक अधिकांश बैक्टीरिया के मॉर्फोटिनारियल अंतर को अलग करने की अनुमति देती है।

खमीर भी इस रंग से प्रतिष्ठित हैं। वे क्रिस्टल वायलेट लेते हैं, यानी वे ग्राम पॉजिटिव को दाग देते हैं।

दूसरी ओर, बीजाणु-गठन ग्राम-पॉजिटिव छड़ को प्रतिष्ठित किया जा सकता है, जिसमें बेसिलस के भीतर एक स्पष्ट स्थान मनाया जाता है, जहां एंडोस्पोर का गठन होता है, हालांकि बीजाणु अच्छी तरह से दाग नहीं करते हैं। अन्य तकनीकों जैसे कि शेफ़र-फुल्टन का उपयोग बीजाणुओं को दागने के लिए किया जाता है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस धुंधला का उपयोग सभी प्रकार के बैक्टीरिया को रंगने के लिए नहीं किया जाता है, अर्थात, ऐसे मामले हैं जिनमें धुंधला काम नहीं करता है।

इस मामले में सेल की दीवार में कमी वाले बैक्टीरिया का उल्लेख किया जा सकता है। उदाहरण के लिए: जीनस मायकोप्लाज्मा, स्फेरोप्लास्ट, यूरियाप्लाज्मा, एल-फॉर्म और प्रोटोप्लास्ट।

यह माइकोलिक एसिड से समृद्ध दीवारों जैसे माइकोबैक्टीरिया, और क्लैमाइडिया और रिकेट्सियास जैसे इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया से बहुत बुरी तरह से बैक्टीरिया को दागता है।

अधिकांश स्पाइरोचेटल बैक्टीरिया को धुंधला करने में भी यह अप्रभावी है।

एक ही जीन के बैक्टीरिया होते हैं जिन्हें ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक के समान नमूने में देखा जा सकता है। जब ऐसा होता है, तो इसे परिवर्तनशील ग्राम दाग कहा जाता है, जो पोषक तत्वों, तापमान, पीएच या इलेक्ट्रोलाइट एकाग्रता में परिवर्तन के कारण हो सकता है।

साधारण गलती

अतिरंजित विरंजन

मलिनकिरण कदम में अतिशयोक्ति झूठी ग्राम नकारात्मक सूक्ष्मजीवों के अवलोकन को जन्म दे सकती है।

विसर्जन तेल जोड़ने के लिए लंबे समय तक सुखाने का इंतजार नहीं करना चाहिए

यह ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया को ग्राम नकारात्मक (झूठे ग्राम नकारात्मक) दाग दे सकता है। ऐसा इसलिए होता है क्योंकि पुरानी संस्कृतियों में मृत या खराब बैक्टीरिया होने की संभावना होती है और इन परिस्थितियों में बैक्टीरिया क्रिस्टल वायलेट को बरकरार नहीं रखते हैं।

बहुत पुराने लुगोल समाधान का उपयोग करें:

समय के साथ लुगोल अपने गुणों को खो देता है और इसका रंग फीका पड़ जाता है। यदि पहले से ही पतित अभिकर्मक का उपयोग किया जाता है, तो यह क्रिस्टल वायलेट को अच्छी तरह से ठीक नहीं करेगा, इसलिए झूठी ग्राम नकारात्मक सूक्ष्मजीवों का एक दृश्य प्राप्त करने की संभावना है।

नीली पृष्ठभूमि

एक उचित रूप से निराश पृष्ठभूमि लाल हो जाएगी। एक नीली पृष्ठभूमि इंगित करती है कि मलिनकिरण अपर्याप्त था।

संदर्भ

1. रेयान केजे, रे सी। 2010. शेरिस। मेडिकल माइक्रोबायोलॉजी, 6 वें संस्करण मैकग्रा-हिल, न्यूयॉर्क, यूएसए
2. कोनमैन ई, एलन एस, जैंडा डब्ल्यू, श्रेकेनबर्गर पी, विन्न डब्ल्यू (2004)। माइक्रोबायोलॉजिकल डायग्नोसिस। (5 वां संस्करण)। अर्जेंटीना, संपादकीय पानामेरिकाना एसए
3. फोर्ब्स बी, साहम डी, वीसफेल्ड ए। 2009. बेली एंड स्कॉट माइक्रोबायोलॉजिकल डायग्नोसिस। 12 एड। अर्जेंटीना। संपादकीय पानामेरिकाना एसए
4. कैसस-रिनकोन जी। 1994. जनरल माइकोलॉजी। 2 एड। सेंट्रल यूनिवर्सिटी ऑफ वेनेजुएला, लाइब्रेरी एडिशन। वेनेजुएला काराकास।
5. "ग्राम दाग।" विकिपीडिया, एक निशुल्क विश्वकोश। 4 अक्टूबर 2018, 23:40 यूटीसी। 9 दिसंबर 2018, 17:11। Es.wikipedia.org से लिया गया।
6. गोंजालेज एम, गोंजालेज एन। 2011. मैनुअल ऑफ मेडिकल माइक्रोबायोलॉजी। दूसरा संस्करण, वेनेजुएला: मीडिया निदेशालय और कैराबोबो विश्वविद्यालय के प्रकाशन।
7. लोपेज़-जेक एल, हर्नांडेज़-ड्यूरन एम, कोलिन-कास्त्रो सी, ओर्टेगा-पेना एस, सेरोन-गोंज़ालेज़ जी, फ्रेंको-केंडेजस एफ। माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशाला में मूल दाग। विकलांगता में अनुसंधान। 2014; 3 (1): 10-18।