डापी (4 ', 6-डायमिडीनो-2-फेनिलइंडोले): विशेषताएँ, औचित्य, उपयोग - रसायन विज्ञान - 2025

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) फ्लोरोसेंट संपत्ति से एक डाई रूप में कार्य करता है एक मार्कर, व्यापक रूप से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की कला में इस्तेमाल किया या प्रवाह cytometry अन्य लोगों के अलावा,। यह जो प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करता है, वह चमकीला नीला होता है, इसकी उत्तेजना 455-461 एनएम (यूवी प्रकाश) के बीच होती है।

डीएपीआई डाई बड़ी आसानी से मृत कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली से गुजर सकती है। यह जीवित कोशिकाओं के नाभिक को भी दाग ​​सकता है, लेकिन इस मामले में, इस की एकाग्रता अधिक होनी चाहिए।

फ्लोरोसेंट डाई DAPI की रासायनिक संरचना। स्रोत: चित्र: फ़ाइल: DAPI.svg इस फ़ाइल का एक वेक्टर संस्करण है। इस रेखापुंज छवि के स्थान पर इसका उपयोग किया जाना चाहिए जब अवर / रिचर्ड व्हीलर (जेफिरिस) संपादित छवि नहीं

डाई सेलुलर डीएनए तक पहुंचने में सक्षम है, जिसके लिए इसकी एक विशेष आत्मीयता है, जो नाइट्रोजस बेस एडेनिन और थाइमिन के लिए बहुत ही मजबूती के साथ बाध्य है। इस कारण से यह कुछ आणविक जीव विज्ञान तकनीकों में बहुत उपयोगी है।

यह यौगिक इंडोल डाइज के समूह से संबंधित है और इसमें एथिडियम ब्रोमाइड और प्रोपीडियम आयोडाइड की तुलना में डीएनए के लिए अधिक संवेदनशीलता दिखाई गई है, विशेष रूप से agarose जैल पर।

इस फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग बहुत व्यापक है, क्योंकि यह उपयोगी है: एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं (कोशिका मृत्यु) में डीएनए में परिवर्तन का अध्ययन करना और इसलिए इस प्रक्रिया में कोशिकाओं का पता लगाना; डीएनए फुटप्रिंटिंग फोटो (डीएनए फोटो प्रिंटिंग) के लिए; बैक्टीरियल संदूषण का अध्ययन करने के लिए; या परमाणु विभाजन की कल्पना करना।

क्रोमोसोमल बैंड के अध्ययन में, माइकोप्लाज्मा एसपी डीएनए का पता लगाने में, डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा कोशिकाओं के धुंधला और गिनती में और यहां तक ​​कि परिपक्व पराग कणों को रंग देने के लिए भी इसका उपयोग किया गया है।

विशेषताएँ

DAPI इसके रासायनिक नाम (4 ', 6-डायमिडीनो-2-फेनिलइंडोल) का संक्षिप्त नाम है। इसका आणविक सूत्र C ₁₆ H ₁₅ N _{5. है।} इसका आणविक भार 350.3 है। यूवी प्रकाश रेंज (345 से 358 एनएम) के पास डीएपीआई-डीएनए कॉम्प्लेक्स की अधिकतम उत्तेजना होती है, जबकि अधिकतम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन 455-461 एनएम के बीच होता है।

इस डाई को पीले पाउडर के रूप में जाना जाता है, लेकिन इस फ्लोरोफोर से चिह्नित संरचनाएं एक शानदार नीली रोशनी का उत्सर्जन करती हैं।

यह पानी में घुलनशील एक यौगिक है, हालांकि, इसके विघटन में तेजी लाने के लिए कुछ गर्मी लागू की जा सकती है। इसे पीबीएस के साथ पतला किया जा सकता है लेकिन इसमें सीधे भंग नहीं किया जाता है।

डाई तैयार होने के बाद, इसे अंधेरे में संग्रहीत किया जाना चाहिए, अर्थात, प्रकाश से संरक्षित, 2 से 8 डिग्री सेल्सियस (रेफ्रिजरेटर) के तापमान पर। इन परिस्थितियों में, डाई 3 सप्ताह या महीनों से अधिक समय तक स्थिर है।

यदि इसे प्रकाश से संरक्षित किया जाता है, लेकिन कमरे के तापमान पर छोड़ दिया जाता है, तो इसकी स्थिरता 2 या 3 सप्ताह तक गिर जाती है, लेकिन प्रत्यक्ष प्रकाश के संपर्क में आने से बहुत तेजी से गिरावट होती है। यदि आप बहुत लंबे समय तक स्टोर करना चाहते हैं, तो इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेट किया जा सकता है।

आधार

यह धुंधला मुख्य आणविक जीव विज्ञान तकनीकों में एक परमाणु काउंटरस्टैन उत्पन्न करने पर आधारित है, जैसे: प्रवाह साइटोमेट्री, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और अन्य लोगों के बीच मेटाफ़ेज़ क्रोमोसोम या इंटरफ़ेज़ नाभिक का धुंधला।

यह तकनीक उस महान आत्मीयता पर आधारित है, जो डाई ने नाइट्रोजनी बेस (एडेनिन और थाइमिन) के लिए है, जो कि मामूली नाली में आनुवंशिक सामग्री (डीएनए) में निहित है। जबकि साइटोप्लाज्मिक स्तर पर यह बहुत कम पृष्ठभूमि छोड़ता है।

जब फ्लोरोसेंट डाई डीएनए के एडेनिन और थाइमिन क्षेत्रों से बांधता है, तो प्रतिदीप्ति काफी बढ़ जाती है (20 गुना अधिक)। यह जो रंग उत्सर्जित करता है वह चमकीला नीला होता है। विशेष रूप से, जीसी (गुआनिन-साइटोसिन) बेस पेयर के लिए बाध्य होने पर कोई प्रतिदीप्ति उत्सर्जन नहीं होता है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यद्यपि इसमें आरएनए के लिए एक आत्मीयता भी है, यह एक समस्या का कारण नहीं बनता है, क्योंकि इस अणु से ऊर्जा उत्सर्जन की उच्चतम डिग्री डीएनए के विपरीत एक और तरंग दैर्ध्य (500 एनएम) पर होती है, जो 460 पर ऐसा होता है एनएम। इसके अलावा, आरएनए के लिए एक बार प्रतिदीप्ति में वृद्धि केवल 20% है।

जीवित कोशिकाओं की तुलना में मृत (निश्चित) कोशिकाओं को दागने के लिए डीएपीआई का उपयोग अधिक किया जाता है, चूंकि बाद वाले को दाग देने के लिए डाई की बहुत अधिक एकाग्रता की आवश्यकता होती है, यह इसलिए है क्योंकि जीवित रहने पर सेल झिल्ली डीएपीआई के लिए बहुत कम पारगम्य है।

डीएपीआई डाई का उपयोग बहु-रंग अनुभव के लिए लाल और हरे फ्लोरोफोरेस के संयोजन में किया जा सकता है।

उपयोग

डीएपीआई (4 ', 6-डायमिडीनो-2-फेनिलइंडोले) एक उत्कृष्ट फ्लोरोफोरे है और इसलिए इसे विभिन्न तकनीकों और विभिन्न उद्देश्यों के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। निम्नलिखित मुख्य तकनीकों में डीएपीआई के उपयोग की व्याख्या करता है।

फ़्लो साइटॉमेट्री

1978 में शोधकर्ताओं गोहडे, शुमान और ज़ांटे ने सबसे पहले डीएपीआई का उपयोग किया और फ्लो साइटोमेट्री तकनीक में एक फ्लोरोफोरे के रूप में प्रस्ताव दिया, डीएनए के प्रति इसकी उच्च संवेदनशीलता और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में इसकी उच्च तीव्रता के कारण बड़ी सफलता मिली।

इस तकनीक में डीएपीआई का उपयोग सेल चक्र के अध्ययन, कोशिकाओं की मात्रा का निर्धारण और जीवित और मृत कोशिकाओं के धुंधला होने की अनुमति देता है।

हालांकि अन्य रंग हैं, जैसे एथिडियम ब्रोमाइड, होचस्ट ऑक्साइड, एक्रिडिन ऑरेंज और प्रोपीडियम आयोडाइड, डीएपीआई सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है क्योंकि यह उन लोगों की तुलना में अधिक फोटोस्टेबल है।

इस तकनीक के लिए कोशिकाओं को ठीक करना आवश्यक है, इसके लिए, पूर्ण इथेनॉल या 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग किया जा सकता है। नमूना अपकेंद्रित्र है और सतह पर तैरनेवाला त्याग दिया जाता है, बाद में कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए पीबीएस बफर के 5 मिलीलीटर जोड़कर हाइड्रेटेड किया जाता है।

जब समय बीतता है, 3 IM की एकाग्रता में एक धुंधला बफर (BioLegend से FOXP3) के साथ DAPI दाग तैयार करें।

नमूना अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और फिर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर DAPI समाधान के साथ कवर करें।

उचित लेज़र के साथ प्रवाह cytometer के लिए नमूना ले लो।

फ्लो माइक्रोफ्लोरोमीटर

एक अन्य तकनीक जिसमें डीएपीआई का उपयोग किया जाता है, एक अन्य फ्लोरोफोर के साथ-साथ माइट्रामाइसिन नामक माइक्रो-फ्लोरोमेट्री प्रवाह में है। दोनों व्यक्तिगत रूप से क्लोरोप्लास्ट डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोगी हैं, लेकिन डीएपीआई टी 4 बैक्टीरियोफेज कणों को मापने के लिए सबसे उपयुक्त है।

संकरण

यह तकनीक मूल रूप से एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किए गए डीएनए जांच का उपयोग करती है जो डीएपीआई हो सकती है।

नमूना को दोहरे फंसे डीएनए को निरस्त करने के लिए हीट ट्रीटमेंट की आवश्यकता होती है और इसे दो सिंगल-स्ट्रैंड स्ट्रैंड में परिवर्तित किया जाता है। यह बाद में डीएपीआई-लेबल वाले विकृतीकृत डीएनए जांच के साथ संकरण किया जाता है जिसमें ब्याज का अनुक्रम होता है।

बाद में जो हाइब्रिड नहीं किया गया था, उसे खत्म करने के लिए इसे धोया जाता है, इसके विपरीत डीएनए की कल्पना की जाती है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप हाइब्रिड जांच के अवलोकन की अनुमति देता है।

इस तकनीक में क्रोमोसोमल डीएनए में विशिष्ट अनुक्रमों का पता लगाने का उद्देश्य है, जो कुछ बीमारियों का निदान करने में सक्षम है।

इन साइबरो-आणविक तकनीकों को करियोटाइप के अध्ययन में विवरण निर्धारित करने में बहुत मदद मिली है। उदाहरण के लिए, उन्होंने एडेनोसिन और थाइमिन के आधार युग्म-समृद्ध क्षेत्रों को हेट्रोक्रोमैटिक क्षेत्रों या डीएपीआई बैंड्स कहा है।

यह तकनीक व्यापक रूप से पौधों और जानवरों में गुणसूत्रों और क्रोमैटिन के अध्ययन के लिए उपयोग की जाती है, साथ ही साथ मनुष्यों में प्रसवपूर्व और हेमटोलॉजिकल पैथोलॉजी के निदान में भी उपयोग की जाती है।

इस तकनीक में, अनुशंसित डीएपीआई एकाग्रता 15 मिनट के समय के लिए 150 एनजी / एमएल है।

इकट्ठे स्लाइड्स को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना

कोशिकाओं को 4% paraformaldehyde के साथ तय किया जाता है। यदि अन्य दागों का उपयोग किया जाना है, तो DAPI को एक काउंटरस्टैन के रूप में अंत में छोड़ दिया जाता है और कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए पीबीएस समाधान के साथ कवर किया जाता है। समय बीतने के साथ, पीबीएस के साथ पतला करके डीएपीआई समाधान तैयार करें, जैसे कि अंतिम एकाग्रता 300 माइक्रोन है।

फिर अतिरिक्त पीबीएस को हटा दिया जाता है और 5 मिनट के लिए डीएपीआई के साथ कवर किया जाता है। कई बार धोता है। स्लाइड को उचित फिल्टर के तहत एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत देखा जाता है।

सुरक्षा शीट

इस यौगिक को देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए, क्योंकि यह एक यौगिक है जिसमें उत्परिवर्तजन गुण होते हैं। सक्रिय कार्बन का उपयोग इस यौगिक को जलीय समाधानों से समाप्त करने के लिए किया जाता है जिन्हें त्याग दिया जाना है।

इस अभिकर्मक के साथ दुर्घटनाओं से बचने के लिए दस्ताने, गाउन और सुरक्षा चश्मा का उपयोग किया जाना चाहिए। यदि त्वचा या श्लेष्म के साथ संपर्क होता है, तो क्षेत्र को पर्याप्त पानी से धोया जाना चाहिए।

आपको इस अभिकर्मक को कभी भी मुंह से नहीं निकालना चाहिए, पिपेट का उपयोग करना चाहिए।

माइक्रोबियल एजेंटों के साथ अभिकर्मक को दूषित न करें क्योंकि यह गलत परिणाम देगा।

अनुशंसित से अधिक डीएपीआई दाग को पतला न करें, क्योंकि यह दाग की गुणवत्ता को काफी कम कर देगा।

प्रत्यक्ष प्रकाश को अभिकर्मक को उजागर न करें, या गर्म रखें क्योंकि यह प्रतिदीप्ति घट जाती है।

संदर्भ

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