इम्यूनोफ्लोरेसेंस: औचित्य, प्रोटोकॉल और अनुप्रयोग - जीवविज्ञान - 2025

इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक शक्तिशाली तकनीक सहसंयोजक फ्लोरोसेंट अणुओं को बंधुआ एक ठोस समर्थन पर तय सेल के नमूनों में विशिष्ट लक्ष्यों की पहचान करने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग कर immunostaining है।

इस तकनीक में प्रतिरक्षात्मक विशिष्टता के साथ सूक्ष्म अवलोकन शामिल है, यह जीवित या मृत कोशिकाओं का निरीक्षण करना संभव बनाता है जो एंटीजन की अल्प मात्रा में पेश कर सकते हैं। यह अनुसंधान के क्षेत्र में और विभिन्न विकृतियों के नैदानिक ​​निदान में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

कार्डियोमायोसाइट कोशिकाओं में एक्टिन फिलामेंट की इम्यूनोलैबलिंग (स्रोत: Ps1415 विकिमीडिया कॉमन्स के माध्यम से)

यह तकनीक, मुख्य रूप से गुणात्मक (कुछ मात्रात्मक वेरिएंट के साथ), विशेष रूप से एक फ्लोरोफोरे के उत्पाद संकेत द्वारा एक नमूना के दृश्य के साथ करना है, जो कि एक फ्लोरोसेंट अणु है जो एक एंटीबॉडी से बंधा है और जो एक निश्चित तरंगदैर्ध्य पर उत्साहित होने में सक्षम है। ।

सेलुलर संदर्भ में, प्रोटीन की उपस्थिति / अनुपस्थिति और उप-कोशिकीय स्थान का अध्ययन करना बहुत उपयोगी है। इस तकनीक का उपयोग शुरू में नैदानिक ​​सेटिंग में वायरस के निदान के लिए किया गया था जैसे कि इन्फ्लूएंजा और बाद में कई अन्य संक्रामक रोगों के लिए।

यह एक अत्यधिक संवेदनशील तकनीक है, और उपयुक्त माइक्रोस्कोपी उपकरण के साथ, इसका बहुत अच्छा समाधान हो सकता है। इसकी आवश्यकता होती है, इसके अवलोकन के लिए, कंफोकल या एपिफ़्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग।

हालांकि, बहुत लोकप्रिय होने के बावजूद, यह गैर-विशिष्ट प्रतिदीप्ति प्राप्त करने के संबंध में कुछ महत्वपूर्ण समस्याएं पेश कर सकता है जो कुछ पृष्ठभूमि "शोर" उत्पन्न करता है, जो अक्सर परिणामों के पर्याप्त पढ़ने को सीमित करता है।

आधार

इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक एंटीबॉडी और एक एंटीजन के बीच बातचीत की प्रतिक्रिया की जैविक घटना के शोषण पर आधारित है। यह विशेष रूप से एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के लिए रोमांचक फ्लोरोसेंट अणुओं द्वारा इस प्रतिक्रिया के दृश्य या पता लगाने के साथ करना है।

एक एंटीबॉडी एक इम्युनोग्लोबुलिन प्रोटीन है जो सक्रिय बी कोशिकाओं से स्रावित होता है, जो विशेष रूप से एक एंटीजन के खिलाफ उत्पन्न होता है, जिससे यह उच्च आत्मीयता और विशिष्टता के साथ बंध सकता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस IgG इम्युनोग्लोबुलिन का उपयोग करता है, जो रक्त सीरम में घुलनशील पाए जाते हैं।

एंटीबॉडीज 950 kDa तक के दो छोटे (प्रकाश) और दो लंबे "Y" -शोषित (भारी) पेप्टाइड श्रृंखलाओं के अणु होते हैं। दोनों प्रकाश और भारी श्रृंखलाओं को दो डोमेन में विभाजित किया गया है: एक चर, एंटीजन को पहचानने में सक्षम, और दूसरा स्थिर या संरक्षित, प्रत्येक प्रजाति की विशेषता।

एंटीजन को कार्यात्मक रूप से अणुओं के रूप में परिभाषित किया जाता है जिन्हें एक एंटीबॉडी द्वारा पहचाना जा सकता है और, अधिकांश भाग, प्रोटीन के लिए होते हैं। जब एक जानवर एक एंटीजन के संपर्क में होता है, तो प्रतिरक्षा प्रणाली के लिम्फोसाइट्स सक्रिय होते हैं, जो इसके खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी का उत्पादन करते हैं और रक्षा प्रणाली के रूप में कार्य करते हैं।

एक एंटीजन, जैसे एक प्रोटीन, उदाहरण के लिए, एक एंटीबॉडी द्वारा एक से अधिक एपिटोप या मान्यता की साइट हो सकती है, इस प्रकार एक एंटीजन के संपर्क में आने वाले जानवर के सीरम में एक ही प्रोटीन के विभिन्न क्षेत्रों के खिलाफ पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी हो सकते हैं।

इम्युनोफ्लोरेसेंस, फिर, एक शुद्ध प्रतिजन के खिलाफ पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन करने के लिए एक जानवर की क्षमता का शोषण करता है ताकि इसे शुद्ध किया जा सके और बाद में अन्य संदर्भों में उसी प्रतिजन की पहचान के लिए इसका उपयोग किया जा सके।

कुछ इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीकों के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट रंजक या अणुओं में फ़्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (FITC), टेट्रामेथिलरोडामाइन आइसोथियोसाइनेट -5 और 6 (TRITC), कई साइनाइन्स जैसे कि Cy2, Cy5 और Cy7 और डाइएं एलेक्सा फ्लोरा® कहलाते हैं।, जैसे एलेक्सा फ्लोर®448।

मसविदा बनाना

इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल कई कारकों के आधार पर भिन्न होता है, हालांकि, और मोटे तौर पर बोलें तो इसमें निम्नलिखित चरणों का एक रैखिक अनुक्रम शामिल है:

• प्लेटों और कोशिकाओं की तैयारी
• नमूनों का निर्धारण
• permeabilization
• ब्लॉक कर रहा है
• इम्यूनोस्टेनिंग या इम्यूनोस्टेनिंग
• विधानसभा और अवलोकन

-Preparation

नमूनों की

नमूनों की तैयारी उनकी प्रकृति और किए जाने वाले अनुभव के प्रकार पर निर्भर करेगी। सबसे सरल मामला, जिसमें निलंबन में कोशिकाओं का उपयोग शामिल है, नीचे समझाया जाएगा।

निलंबन में कोशिकाओं, अर्थात्, एक तरल संस्कृति के माध्यम में, पहले इसे सेंट्रीफ्यूजेशन से अलग किया जाना चाहिए और फिर एक बफर समाधान या isosmotic "बफर" से धोया जाना चाहिए, जो उनकी अखंडता को संरक्षित करता है।

आम तौर पर, पीबीएस के रूप में जाना जाने वाला फॉस्फेट-सलाइन बफर का उपयोग किया जाता है, जिसमें कोशिकाओं को फिर से जोड़ा जाता है और संस्कृति के माध्यम से कोशिकाओं को मुक्त करने के लिए इस मिश्रण को फिर से सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, जिसमें हस्तक्षेप करने वाले पदार्थ हो सकते हैं।

ब्लेड की

माइक्रोस्कोपिक अवलोकन के लिए उपयोग की जाने वाली स्लाइड, जहां कोशिकाओं को बाद में इसी डाउनस्ट्रीम उपचार के लिए तय किया जाएगा, को भी सावधानीपूर्वक तैयार किया जाना चाहिए।

ये पॉली-लाइसिन के एक समाधान के साथ कवर या "संवेदीकृत" होते हैं, एक सिंथेटिक बहुलक जो कोशिकाओं और ठोस समर्थन के बीच "आणविक गोंद" के रूप में कार्य करेगा, उनके एमिनो समूहों के सकारात्मक आरोपों के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत के लिए धन्यवाद। कोशिकाओं को कोट करने वाले प्रोटीन पर नकारात्मक चार्ज।

नमूनों का निर्धारण

इस प्रक्रिया में कोशिका के अंदर पाए जाने वाले प्रोटीन को स्थिर करने के लिए होता है ताकि उनके स्थानिक स्थान को बरकरार रखा जा सके। उपयोग किए जाने वाले अणु सभी प्रकार के सेल झिल्ली को पार करने और सहसंयोजक प्रोटीन के साथ लैटिस बनाने में सक्षम होना चाहिए।

Formaldehyde और paraformaldehyde, glutaraldehyde और यहां तक ​​कि मेथनॉल का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, जिसके साथ सेल के नमूने एक निश्चित समय के लिए incubated होते हैं और फिर एक isosmotic बफर समाधान के साथ धोया जाता है।

कोशिकाओं को ठीक करने के बाद, वे पॉली-लाइसिन के साथ संवेदीकृत चादरों से जुड़े रहते हैं।

permeabilization

परीक्षण के प्रकार के आधार पर, अध्ययन के तहत कोशिकाओं को पारगम्य बनाना आवश्यक होगा या नहीं। यदि जो मांगा गया है, वह कोशिका की सतह पर एक निश्चित प्रोटीन की स्थिति, उपस्थिति या अनुपस्थिति को जानने के लिए है, तो अनुमति देना आवश्यक नहीं होगा।

दूसरी ओर, यदि आप कोशिका के अंदर एक प्रोटीन का स्थान जानना चाहते हैं, तो पारगम्यता आवश्यक है और इसमें ट्राइटन X-100 के साथ नमूनों को सम्मिलित करना शामिल होगा, जो सेल झिल्ली को पार करने में सक्षम एक डिटर्जेंट है।

ब्लॉक कर रहा है

सभी प्रतिरक्षाविज्ञानी तकनीकों में एक मौलिक कदम अवरुद्ध है। प्रक्रिया के इस चरण में, ब्लॉकिंग में कवरिंग शामिल हैं, संवेदी शीट पर, पॉली-लाइसिन अणुओं के साथ सभी साइटें, जिन पर कोशिकाओं का पालन नहीं हुआ था। यही है, यह किसी भी निरर्थक संघ को रोकता है।

आम तौर पर पीबीएस बफर में गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के साथ समाधान अवरुद्ध करने के लिए उपयोग किया जाता है और इस समाधान के साथ सबसे अच्छा परिणाम ऊष्मायन समय प्राप्त किया जाता है। अवरुद्ध करने सहित प्रत्येक चरण के बाद, शेष समाधान को धोना आवश्यक है।

इम्यूनोस्टेनिंग या इम्यूनोस्टेनिंग

Immunostaining या Immunostaining प्रक्रिया मुख्य रूप से इस बात पर निर्भर करेगी कि यह प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष Immunofluorescence है (नीचे देखें)।

यदि यह एक प्राथमिक या प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस है, तो नमूनों को वांछित एंटीबॉडी के साथ जोड़ा जाएगा, जिसे फ्लोरोसेंट रंजक के साथ जोड़ा जाना चाहिए। ऊष्मायन प्रक्रिया में एक समाधान में एंटीबॉडी का कमजोर पड़ना होता है जिसमें बीएसए भी शामिल होगा लेकिन कम अनुपात में।

जब मामला द्वितीयक या अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस का होता है, तो दो लगातार ऊष्मायन किए जाने चाहिए। पहले वांछित एंटीबॉडी के साथ और फिर एंटीबॉडी के साथ जो प्राथमिक इम्युनोग्लोबुलिन के निरंतर क्षेत्रों का पता लगाने में सक्षम हैं। यह इन द्वितीयक एंटीबॉडी हैं जो कोवलोरिक रूप से फ्लोरोफोर्स से बंधे होते हैं।

तकनीक बहुत बहुमुखी है, साथ ही प्रति नमूना एक से अधिक प्रतिजन के लेबलिंग की अनुमति देता है, जब तक कि प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस के मामले में, विभिन्न फ्लोरोफोरेस को युग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी होते हैं।

अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस में एक साथ लेबलिंग के लिए, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी का उत्पादन एक अलग जानवर में किया जाता है, साथ ही साथ प्रत्येक माध्यमिक एंटीबॉडी को एक अलग फ्लोरोफोर में जोड़ा जाता है।

अवरुद्ध करने की तरह, एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन इस के समय को बेहतर परिणाम देता है। प्रत्येक चरण के बाद, अतिरिक्त एंटीबॉडी को धोने के लिए आवश्यक है जो नमूनों में नहीं बंधे थे और द्वितीयक इम्यूनोफ्लोरेसेंस में माध्यमिक एंटीबॉडी को जोड़ने से पहले ब्लॉक करना आवश्यक है।

कुछ तकनीकें अन्य दागों का उपयोग करती हैं जो प्रतिरक्षा से संबंधित नहीं हैं, जैसे कि डीएपीआई फ्लोरोफोर के साथ परमाणु डीएनए का धुंधला होना।

विधानसभा और अवलोकन

फ़्लोरोफ़ोर्स के साथ अंतिम ऊष्मायन समय के दौरान यह आवश्यक है कि नमूने अंधेरे में रहें। माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन के लिए, एंटीबॉडी के लिए युग्मित फ्लोरोफोरस के प्रतिदीप्ति को संरक्षित करने के लिए कुछ पदार्थों का उपयोग करना आम है।

प्रकार

प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष इम्युनोफ्लोरेसेंस का ग्राफिक सारांश (स्रोत: वेस्टहेल 618 विकिमीडिया कॉमन्स के माध्यम से)

प्रत्यक्ष या प्राथमिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस

यह फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के उपयोग के माध्यम से एंटीजन का पता लगाने के साथ करना है। इस तकनीक का उपयोग करने का मुख्य लाभ इसकी गति है, हालांकि, प्रक्रिया में कई प्रकार के गैर-बाध्यकारी बंधन हो सकते हैं, खासकर जब मानव सीरा का अध्ययन करते हैं, क्योंकि वे अत्यधिक विषम एंटीबॉडी से समृद्ध होते हैं।

अप्रत्यक्ष या माध्यमिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस

इसे "सैंडविच" तकनीक के रूप में भी जाना जाता है और इसमें दो चरणों में तकनीक का विकास शामिल है। पहले गैर-फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के उपयोग और ब्याज के प्रतिजन के लिए इसके बंधन के साथ करना है।

इस पहले एंटीबॉडी के निरंतर क्षेत्र के खिलाफ (जो अब प्रतिजन के रूप में काम करेगा) एक दूसरा एंटीबॉडी पहचानने में सक्षम है, जिसका उपयोग एक फ्लोरोसेंट अणु के साथ जुड़ा हुआ है।

फ्लोरोसेंट सिग्नल की उपस्थिति पहले गैर-फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी और ब्याज के प्रतिजन के बीच विशिष्ट मान्यता का परिणाम होगी; इस पहले एंटीबॉडी की उपस्थिति दूसरे की है, जिसे लेबल किया गया है और जिसके लिए एंटीजन की उपस्थिति या अनुपस्थिति निर्धारित की जा सकती है।

प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस की तुलना में बहुत अधिक समय लेने वाली तकनीक होने के बावजूद (क्योंकि इसमें एक और ऊष्मायन चरण शामिल है), इस तकनीक में अध्ययन किए गए प्रत्येक एंटीजन के लिए एक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के डिजाइन को शामिल नहीं किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप, आर्थिक संदर्भ में, अधिक व्यवहार्य।

इसके अलावा, यह सिग्नल प्रवर्धन के संदर्भ में एक अधिक संवेदनशील तकनीक है, क्योंकि एक से अधिक माध्यमिक एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी के निरंतर क्षेत्र में बंध सकते हैं, इस प्रकार फ्लोरोसेंट सिग्नल की तीव्रता को बढ़ा सकते हैं।

अनुप्रयोग

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक अत्यंत बहुमुखी तकनीक है, जिसका उपयोग वैज्ञानिक और नैदानिक ​​क्षेत्रों में कई तरीकों से किया गया है। इसका उपयोग कई जीवों के संबंध में पारिस्थितिक, आनुवांशिक और शारीरिक सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है।

नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में, इसका उपयोग कुछ त्वचा रोगों के प्रत्यक्ष निदान के लिए किया जाता है, या तो अध्ययन किए गए रोगियों के उपकला ऊतक पर प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष इम्युनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करते हैं।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक एककोशिकीय जीवों में उपलब्ध है जैसे खमीर को इंट्रान्यूक्लियर और साइटोप्लाज्मिक माइक्रोट्यूबुल्स, एक्टिन और संबंधित प्रोटीन, 10nm फिलामेंट्स और साइटोप्लाज्म, झिल्ली और सेल की दीवारों के अन्य घटकों की कल्पना करने के लिए।

संदर्भ

1. Abcam, Immunocytochemistry और इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल। Abcam.com से लिया गया
2. ग्रीफ, सी। (2012)। फ्लोरोसेंट रंजक। Leica-microsystems.com से लिया गया
3. मिलर, डीएम, और शेक्स, डीसी (1995)। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी। सेल बायोलॉजी में तरीके (वॉल्यूम 48, पीपी। 365-394)। शैक्षणिक प्रेस, इंक।
4. ओडेल, आईडी और कुक, डी। (2013)। इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक। खोजी त्वचाविज्ञान जर्नल, 133, 1–4।
5. प्रिंसल, बीजेआर, एडम्स, एईएम, ड्रूइन, डीजी, और ब्रायन, के। (1991)। खमीर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस के तरीके। एंजाइमोलॉजी के तरीके (वॉल्यूम 194, पीपी। 565–602)। शैक्षणिक प्रेस, इंक।
6. शेफ़र, एम।, ओर्सी, ई। वी, और विडेलॉक, डी। (1964)। पब्लिक हेल्थ वायरोलॉजी में इम्यूनोफ्लोरेसेंस के अनुप्रयोग। जीवाणु समीक्षा, २, (४), ४०२-४०,।
7. वेरलिंग, ईजी, एंडरसन, डीएम (1996)। फाइटोप्लांकटन अनुसंधान में इम्यूनोफ्लोरेसेंस: अनुप्रयोग और क्षमता। जे: फ़ाइकोल।, 32, 1–16।